تولیدکننده مکمل های پروبیوتیک دام، طیور و آبزیان

شرکت دانش بنیان زیست درمان ماهان

گزارش علمی

 

شهریور و مهر ۱۴۰۱

 

تولیدکننده مکمل های پروبیوتیک دام، طیور و آبزیان

 

شرکت دانش بنیان زیست درمان ماهان

 

بررسی اثر ممانعتی میکروارگانیسمهای پروبیوتیک علیه ویبریو جداسازی شده از نمونه های مرضی میگو در استخرهای پرورشی جنوب ایران

 

1

 

مقدمه:

 

با توجه به شیوع بیماری ویبریوز ناشی از باکتری ویبریوپاراهمولیتیکوس در ایران و زیان ناشی از این بیماری، شرکت دانش بنیان زیست درمان ماهان در پی ارجاع وظیفهی سازمان محترم شیلات ایران در جهت کمک به رفع چالشهای صنعت دام، طیور و آبزیان کشور آمادگی خود را برای همکاری با سازمان شیلات کشور به منظور حل چالش فوق الذکر از طریق طراحی محصولی دانش بنیان جهت مقابله با عامل این بیماری اعلام نمود. به همین منظور از استخرهای پرورش میگوی مبتلا به ویبریوز توسط کارشناسان محترم شیلات استان هرمزگان نمونهبرداری به عمل آمد و نمونههای فریز شده با هواپیما به تهران و سپس آزمایشگاه این شرکت در پارک علم و فناوری پردیس انتقال یافتند و عامل بیماری جداسازی و سپس آزمایشهای مورد نظر بر روی عامل بیماری بهعملآمد. ذیلاا گزارش کامل اقدامات انجام شده و نتایج حاصله و پیشنهادات و محصولات طراحی شده به استحضار می رسد.

 

بیماری ویبریوز:

 

ویبریوز بیماری باکتریایی با عامل باکتری گونه ویبریو است. این باکتری گرم منفی، متحرک، بیهوازی اختیاری از خانوادهی Vibrionaceaeاست. این بیماری در تمامی آبزیان دریایی میتواند بیماریزا باشد و عامل تلفات در سراسر جهان است. مطالعات متعددی نشان داده است که استفاده از پروبیوتیکها، ریزجلبکها، باکتریوفاژها و بعضی عوامل گیاهی میتواند در کنترل این بیماری موثر باشد. مقادیر بالای ویبریو در استخرهای پرورشی آبزیان احتمال ابتلا به بیماریهای ویروسی همچون لکهی سفید را بالا میبرد. ویبریوز عامل تعدادی از بیماریهای باکتریایی است و شامل بیماریهای زیر است:

 

سپتیسمی باکتریال:

 

سپتی سمی باکتریال یکی از شدیدترین بیماریهای ایجاد شده توسط ویبریو در میگو است که با علایم بیحالی، شنای غیر طبیعی، اتساع کروماتوفورها، قرمز شدن پاهای شنا که در عضلات شکمی دیده میشود. در موارد مزمن، پوششهای آبشش به شکل قرمز و ملتهب و دچار ساییدگی و خوردگی دیده میشوند. تاولهای سیاه و ملانیزه در پوسته و شکم دیده میشود. افزایش ضریب تبدیل مشاهده میشود.با بهبود کیفیت آب از طریق کاهش بار آلی و تعویض آب می توان از سپتی سمی باکتریال پیشگیری کرد. همچنین غذای دارای پروتئین بالا توصیه می شود.

 

2

 

نکروز (هپاتوپانکراس، عضله و ضمایم)

 

التهاب سلولها موجب افزایش خروج پروتئین از بافت و سلولها میشود که باعث تغییر رنگ آبزی به سفید شیری میگردد. این بیماری با شرایط نامناسب محیطی مانند کیفیت آب، بار آلی، سوء تغذیه و افزایش کود و مدفوعات در استخر به وقوع میپیوندد.

 

فاکتورهای مسئول در همهگیری بیماری:

 

محیط نامساعد مانند کیفیت پایین آب و خاک تجهیزات نامناسب تعویض و هوادهی آب در حجمهای بالا استفاده از خوراک با کیفیت پایین و پروتئین ناکافی تجمع لجن زیاد در کف استخر به علت هضم نامناسب غذا وجود ویبریو در میکروفلور روده و آب استخر

 

زیان سالیانهی ویبریوز در میگو حدود ۴/۵میلیارد دلار است. ویبریوز توانایی ایجاد تلفات صددرصدی در مزارع میگو را دارد. در دو سال گذشته همهگیری ویبریو پاراهمولیتیکوس آسیب قابل توجهی به مزارع میگو در سراسر جهان وارد کرد که تلفات ۱۵-۲۰درصدی گزارش شده است و متاسفانه آلودگی به کشور ما رسیده است. بطور کلی میتوان کاهش کیفیت آب را یکی از مهمترین عوامل بیماریزایی این باکتری در نظر گرفت.

 

راه های مقابله و کنترل بیماری:

 

طبیعتا گام اول در درمان بیماریهای باکتریال، استفاده از آنتیبیوتیکهاست. اما استفاده از آنتیبیوتیکها در آبزیان و علی الخصوص مزارع پرورش میگو به دلایلی همچون سختی استفاده (آنتیبیوتیک فقط در خوراک قابل استفاده است) و باقیماندهی آنتی بیوتیک که در صادرات مشکل ایجاد میکند، پرهزینه و غیرممکن است. به همین دلیل سیاست اصلی مزرعه داران باید پیشگیری و کنترل بیماری باشد. حفظ کیفیت آب مصرفی و کاهش عوامل استرسزا و بیماریزا مهم ترین راهکارهای کنترل بیماری هستند. طبق مطالعات متعدد، استفاده از عوامل بر پایهی فناوری زیستی (پروبیوتیکها، باکتریوفاژها، جلبکها و فیتوبیوتیکها) یکی از راههای کنترل بیماری است. استفاده از پروبیوتیکها در کنار راهکارهای مدیریتی حفظ کیفیت آب (مانند تعویض آب و هوادهی) به عنوان راهکاری ارزان و در دسترس در کاهش ابتلا به بیماری موثر است. طبق بررسی انجام شده با تعدادی از پرورش دهندگان میگو که مصرفکنندهی

 

3

 

مکملهای پروبیوتیک این شرکت هستند، دریافتیم که استفاده از مکمل پروبیوتیک Bio-Aqua® Pondبا دوز بالاتر (دو بار در هفته) به همراه افزایش دفعات تعویض آب توانسته از تلفات ویبریوز در مزارع میگو پیشگیری کند. پروبیوتیکها میکروارگانیسمهای زندهای هستند که استفاده از آنها به مقدار مناسب میتواند برای میزبان اثرات سلامت بخش داشته باشد. مکمل پروبیوتیک Bio-Aqua® Pondترکیبی از ۴سویه باکتریال است که بر اساس آزمایش های In Vitroو In Vivoبرگزیده و بطور اختصاصی برای استفادهی مستقیم در استخرهای تولیدی آبزیان فرموله شده است. شرایط تولید صنعتی آبزیان همچون تراکم بالا، استرسهای تولید و تغذیه، آلودگی آب، چالشهای مدیریتی و همه گیری بیماریهای عفونی موجب تضعیف سیستم ایمنی و برهمخوردن تعادل میکروبی دستگاه گوارش و در نتیجهی آن رشد و تولید میکروارگانیسمهای مضر و تولید سموم و متابولیتهای آسیبزا میشود. تغییرات در آب استخرهای پرورشی و افزایش متابولیتهایی همچون نیترات و مواد آلی نیز میتواند تاثیر منفی بر شرایط فوق داشته باشد. در نتیجهی چنین تغییراتی کاهش عملکرد و افزایش تلفات در فارمهای آبزیان مشاهده میشود. مکمل پروبیوتیک Bio-Aqua® Pondراه حلی است برای افزایش کیفیت آب استخرهای پرورشی آبزیان و کاهش عوامل بیماریزای آن.

 

ترکیب محصول:

 

• Bacillus licheniformis

 

• Bacillus subtilis

 

• Pediococcus acidilactici

 

• Lactobacillus acidophilus

 

• Filler & Carrier: Calcium Carbonate

 

• Min. Count: 2×۱۰۹ CFU/g

 

شیوه عملکرد پروبیوتیکها در استخرهای پرورشی آبزیان:

 

تجزیه و تبدیل مواد آلی، پاکسازی پساب استخر: مواد آلی باقیماندهی غذا و دفعی آبزی، در کف استخر مجتمع شده و محلی برای رشد میکروارگانیسمهای پاتوژن میشوند، همچنین متابولیزاسیون این مواد باعث مصرف اکسیژن آب و کاهش اکسیژن محلول میشود. این مواد باعث افزایش رشد (بلوم بیش از حد) جلبکی میشوند که به نوبهی خود اکسیژن آب را کاهش داده و شرایط را برای رشد آبزی نامساعد میسازد. پروبیوتیکها در فرایند بیهوازی

 

4

 

مواد آلی را مصرف و متابولیزه میکنند، از رشد پاتوژنها پیشگیری میکنند و شکوفایی جلبکی را نیز تنظیم میکنند؛ در نتیجه اکسیژن آب تثبیت میشود. خنثی کردن اثر سموم، حذف عوامل استرسزا و سمی مانند نیتروژن): (NH3,N2O,NO پروبیوتیکها توانایی بالای در سمزدایی دارند و میتوانند انواع سموم قارچی (آفلاتوکسین، زایرلنون،) میکروبی (اندوتوکسین و لیپوپلی ساکارید و…،) شیمیایی و فلزات سنگین را متابولیزه و خنثی کنند. مواد نیتروژنه مانند آمونیاک نتیجهی متابولیسم پروتئین در بدن آبزی هستند و انباشته شدن آنها در محیط آب موجب آسیب به آبزی میشود. این سموم می توانند به سیستم تنفسی و ایمنی آسیب جدی واردکنند. پروبیوتیکها خصوصاا خانوادهی باسیلوس توانایی استفاده از منابع نیتروژن برای پروتئینسازی را دارند و باعث کاهش سموم نیتروژنه در آب میشوند.

حذف عوامل استرسزا و تقویت عملکرد سیستم ایمنی: استرس با تضعیف عملکرد سیستم ایمنی توانایی مقابله با بیماریها را کاهش میدهد. با توجه به این که سیستم ایمنی میگو حافظهی ضعیفی دارد، وجود پروبیوتیک ها به عنوان تقویت کنندهی سیستم ایمنی باعث آمادگی بالاتر سیستم ایمنی برای پاسخدهی به عوامل پاتوژن از جمله عوامل باکتریال و ویروسی میشود. به همین دلیل وجود پروبیوتیک در آب یا جیره ی غذایی باعث آمادگی بالاتر و بهبود عملکرد سیستم ایمنی در برابر عوامل بیماری زا می شود. در نتیجهی فرایندهای فوق، پروبیوتیک ها می توانند مولفه های کیفی آب را تثبیت و شرایط را برای بهره وری حداکثری استخرهای پرورشی آبزیان مهیا کنند.

 

طبق بررسی انجام شده از تعدادی از مصرفکنندگان مکمل پروبیوتیک Bio-Aqua® Pondدریافتیم که با افزایش دفعات استفاده از این محصول و افزایش دفعات تعویض آب توانسته بودند از وقوع بیماری ویبریوز ناشی از همه گیری ویبریو پاراهمولیتیکوس به مزارع خود پیشگیری کنند. اما این همهگیری طراحی محصولی اختصاصی که بتواند از وقوع بیماری در مزرعه پیشگیری کند را ضروری میسازد.  هدف از این مطالعه جداسازی و شناسایی باکتری ویبریو پاراهمولیتیکوس از نمونه های میگو و بررسی اثرات ضدباکتریایی سویه های مختلف پروبیوتیک و همچنین محصول Bio-Aqua® Pondعلیه این جدایهها میباشد.

 

5

 

مواد و روش ها:

 

-1مواد، تجهیزات و محیطهای کشت مورد نیاز

 

مواد، تجهیزات و محیط کشتهای مصرفی در این مطالعه تجربی در جدول ذیل بیان شده است: جدول :۱فهرست مواد، تجهیزات و محیط کشت ها

 

مواد و محیطهای کشت	تجهیزات
محیط کشت آب پپتونه نمکی ( )ASPW	انکوباتور شیکردار ۳۷درجه هوازی
محیط کشت TSCB Agar	انکوباتور شیکردار ۴۱/۵درجه هوازی
محیط کشت SDS Agar	انکوباتور ۳۷درجه هوازی
محیط کشت TSAنمکی	انکوباتور ۴۱/۵درجه هوازی
محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز براث	هود لامینار کلاس II
محیط کشت آرژنین دهیدرولاز براث	فریزر -۲۰درجه سانتیگراد
محیط کشت پپتون واتر ( )PW	اتوکلاو
محیط کشت TSIآگار	سمپلر
محیط کشت نیمه جامد SIM	خط کش/کولیس
دیسک ONPG	ورتکس
دیسک اکسیداز	میکروسکوپ
معرف کواکس	ملزومات شیشه ای
نمک ( )NaCl	سوآب
روغن معدنی	اسپکتوفتومتر

 

6

 

-2روش کار:

 

دوگروه نمونه میگو در قالب گروه ( ۱میگو بزرگ) و گروه ( ۲میگو کوچک) با هدف جداسازی و شناسایی باکتری ویبریو پاراهمولیتیکوس و بررسی اثرات ضدباکتریایی سویههای مختلف پروبیوتیک و همچنین محصول Bio-Aqua®Pondعلیه این جدایه ها از دو مرکز پرورش میگو در شهرستان بندرعباس در کول باکس و با حفظ زنجیره سرمایی به آزمایشگاه میکروبیولوژی ماهان ارسال شد (شکل .)۱

 

شکل :۱نمونه میگوی ارسالی به آزمایشگاه

 

در ابتدا نمونهها در دفتر ثبت نمونهی آزمایشگاه ثبت شد و بالافاصله در فریزر -۲۰درجه سانتیگراد تا زمان انجام آزمون قرنطینه گردید. جداسازی و شناسایی گونههای ویبریو مطابق با استاندارد ۹۶۶۷-۱انجام شد. بدین صورت که ابتدا میگوها در شرایط کنترل شده پاکسازی شد، سپس ۲۵گرم از هر یک از نمونهها وزن شد و به صورت جداگانه به دو محیط حاوی ۲۲۵میلی لیتر آب پپتونه نمکی ( )ASPWاضافه گردید. یکی از نمونهها در دمای ۳۷درجه سانتیگراد و نمونهی دیگر در دمای ۴۱/۵درجه سانتیگراد به مدت ۶±۱ساعت گرمخانه گذاری گردید. بعد از پایان زمان گرمخانه گذاری به منظور غنی سازی ثانویه یک میلی لیتر از هریک از کشت های بدست آمده از غنی سازی اولیه به لوله های حاوی ۱۰میلی لیتر محیط ASPWتلقیح گردید. هر گروه از محیط های تلقیح شده ASPWبه صورت جداگانه مجدداا در دمای ۳۷درجه سانتیگراد و نمونه دیگر در دمای ۴۱/۵درجه سانتیگراد به مدت ۱۸±۱ساعت گرمخانه گذاری گردید. پس از اتمام زمان گرمخانه گذاری، از هر یک از نمونه های تلقیح شده ASPWبا استفاده از حلقه کشت مقدار یک میکرولیتر برداشته و بر روی محیط TSCB Agarو همچنین محیط کشت SDS Agarبه صورت جداگانه کشت داده شد (شکل .)۲هر یک از محیط های کشت داده شده در دمای ۳۷±۱درجه سانتیگراد به مدت ۱۸-۲۴ساعت

 

7

 

گرمخانهگذاری گردید. پس از پایان زمان گرمخانهگذاری کلنیهای رشدیافته از نظر وجود باکتریهای ویبریو پاراهمولیتیکوس(کلنی های سبز تیره بر روی محیط TSCB Agarو کلنی های زرد بدون هاله برروی محیط SDS )Agarبرررسی شد. کلنی های انتخاب شده بر روی محیط کشت TSAنمکی کشت داده شد. آزمون های تاییدی شامل رنگ آمیزی گرم، تست اکسیداز، آزمون تخمیر قندها، تست اندول، آزمون حضور لیزین دکربوکسیلاز و آرژنین دهیدرولاز، آزمون ONPGو همچنین آزمون مقاومت به درصدهای مختلف نمک و pHهای مختلف بر روی کلنیهای مشکوک انجام شد.

 

شکل :۲کشت از محیط ASPWروی محیط کشت های TSCBو SDSآگار نتایج حاصل از آزمون های بیوشیمیایی و میکروبی در جدول ۱بیان شده است (جدول .)۱براساس نتایج حاصل از کشت بر روی محیط های TSCB Agarو SDS Agarو همچنین آزمون های بیوشیمایی انجام شده چهار جدایی به دست آمده از آزمون ها شامل B ،A-2 ،A-1و Gجدایه های مشکوک به ویبریو پاراهمیولیتیکوس بودند. نمونه های مشکوک به پاراهمولیتیکوس بر روی محیط TSCB Agarبه رنگ سبز (سبز-زرد) و بر روی محیط SDS Agarبه رنگ زرد مشاهده شد (شکل .)۳تمامی سویه های جداسازی شده طبق رنگ آمیزی گرم از نوع باسیل گرم منفی بودند. آزمون اکسیداز و اندول برای تمامی سویه های جداسازی شده مثبت بود. بر اساس داده های به دست آمده حاصل از کشت بر روی محیط TSIهر چهار جدایه جداسازی شده لاکتوز منفی، گلوکز مثبت و از نظر تولید گاز و سولفید منفی بودند (شکل .)۴سایر آزمون های بیوشیمیایی دیگر شامل آزمون دکربوکسیلاسیون ال-لیزین در محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز براث، آزمون دهیدرولاسیون آرژنین در محیط آرژنین دهیدرولاز براث و همچنین هیدرولیز ONPGبرای جدایه های مشکوک انجام شد که نتایج آنها ترتیب مثبت، مثبت و منفی بود (شکل .)۵

 

8

 

جدول :۱نتایج حاصل از آزمون های تشخیصی و افترافی برای ایزوله های مشکوک ویبرو جداسازی شده از نمونه های میگو

 

G	F	E	D	C	B	A-2	A-1
TCBS Agar	SDS Agar	TCBS Agar	SDS Agar	TCBS Agar	SDS Agar	TCBS Agar	TCBS Agar	محیط کشت
کلنی زرد رنگ	کلنی زرد رنگ	کلنی سبز و زرد رنگ	کلنی زرد رنگ	کلنی سبز و زرد رنگ	کلنی قهوه ای و ارغوانی	ویژگی ماکروسکوپی	کلنی سبز تیره	کلنی سبز تیره
رنگ آمیزی گرم	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی	باسیل گرم منفی
اکسیداز	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت
تخمیر قند ( )TSI	قرمز-زرد/– G	قرمز-زرد/– G	قرمز-زرد/– G	قرمز-زرد/+ G	زرد-زرد/– G	زرد-زرد/– G	قرمز-زرد/– G	زرد-زرد/-G
اندول	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت
لیزین دکربوکسیلاز	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	منفی	منفی	مثبت	مثبت
آرژنین دهیدرولاز	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت	مثبت
هیدرولیز ONPG	منفی	منفی	منفی	ND	ND	ND	ND	منفی
–	–	–	–	+	–	–	–	PW+0% NaCl
+	+	+	+	+	+	+	+	PW+2% NaCl
+	+	+	+	+	+	+	+	PW+6% NaCl
+	–	+	+	+	–	+	+	PW+8% NaCl
–	–	–	–	–	–	–	–	PW+10% NaCl
مشکوک به پاراهمولیتیکوس	پاراهمولیتیکوس نیست (الگوی نمک)	پاراهمولیتیکوس نیست( LDCمنفی لاکتوز مثبت)	پاراهمولیتیکوس نیست ( LDCمنفی)	پاراهمولیتیکوس نیست (گاز و الگوی نمک)	مشکوک به پاراهمولیتیکوس/ ولنیفیکوس	مشکوک به پاراهمولیتیکوس	مشکوک به پاراهمولیتیکوس	نتیجه اولیه

 

9

 

تصویر :۳نمونه های مشکوک به پاراهمولیتیکوس بر روی محیط TSCB AgarوSDS Agar

 

تصویر :۴کشت نمونه های مشکوک به پاراهمولیتیکوس بر روی محیط محیط TSI Agar

 

10

 

مطابق نتایج به دست آمده از آزمون مقاومت به درصدهای مختلف نمک هر چهار جدایه مشکوک به پاراهمولیتیکوس در محیط بدون نمک و حاوی ۱۰درصد نمک رشدی نداشتند با این وجود در محیط حاوی ۲و ۶درصد نمک رشد داشتند (شکل .)۶نتایج حاصل از آزمون رشد در pHهای مختلف در جدول ۲بیان شده است. مطابق با نتایج هر چهار جدایه مشکوک در pH=5رشد نداشته ولی در سایر pHها رشد داشتند.

 

شکل :۵آزمون دکربوکسیلاسیون ال-لیزین در محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز براث و آزمون دهیدرولاسیون آرژنین در محیط آرژنین دهیدرولاز براث

 

تصویر :۶نتایج حاصل از آزمون رشد در pHهای مختلف

 

11

 

جدول :۲نتایج آزمون قابلیت رشد گونه های ویبرو جداسازی شده در pHهای مختلف

 

-: عدم رشد :+ رشد

 

به منظور برررسی اثرات ضدمیکروبی ۱۰سویه پروبیوتیک ،Bacillus licheniformis ،Bacillus subtilis

 

،Lactobacillus acidophilus ،Enterococcus faecium ،Pediococcus acidilactici

 

،Lactoibacillus casei ،Lactoibacillus rhamnosus ،Streptococcus salivarius

 

Bio-Aqua® Pond و همچنین محصولStreptococcus thermophilus ، Bifidobacterium bifidum

 

علیه جدایههای مشکوک ویبریو پاراهمولیتیکوس به دست آمده از نمونه های میگو از روش چاهک گذاری روی آگار ( )Agar Spot Testاستفاده شد. همچنین به منظور بررسی اثر ضدمیکروبی آنتی بیوتیکهای رایج علیه جدایههای به دست آمده از روش دیسکگذاری (روش کربی – بائر) با استفاده از دیسکهای آنتی بیوتیکی (شرکت پادتن طب، ایران) استفاده گردید. همه آزمونها سه بار تکرار شد. نتایج حاصل از تاثیر ضدمیکروبی سویه های پروبیوتیک و محصول بایوآکوآ پوند ( با غلظت ۱۰۰۰ mg/mlو )۵۰۰ علیه ایزوله های جداسازی شده ویبریو در جدول ۳بیان شده است (جدول .)۳بر اساس نتایج به دست آمده غلظت های مختلف این محصول تاثیر قابل توجهی بر روی نمونه جداسازی شده Gداشت (شکل )۷با این وجود اثر ضدمیکروبی معنیداری از غلظتهای مختلف محصول علیه جدایههای B ،A-2 ،A-1مشاهده نگردید. با توجه به نتایج از بین ۱۰سویه پروبیوتیک مورد بررسی سویه Pediococcus acidilacticiبیشترین تاثیر ضدمیکروبی علیه جدایه های A-1و A-2به ترتیب با میانگین قطر هاله ۲۱/۳۳و ۱۹/۶۶میلیمتر را داشت (شکل )۸و کمترین اثر ضد میکروبی علیه این جدایه ها مربوط به سویه Bacillus subtilisبود. بیشترین و کمترین اثر ضدمیکروبی علیه نمونه جداسازی شده Bبه ترتیب مربوط به سویه پروبیوتیک Bacillus subtilisبا میانگین قطر هاله عدم رشد ۳۰/۳۳میلیمتر (شکل )۹و سویه Lactoibacillus rhamnosusبا میانگین قطر هاله عدم رشد ۶/۶۶ میلیمتر مشاهده گردید. همچنین بیشترین تاثیر ضدمیکروبی علیه نمونه ویبریو جداسازی شده Gرا سویه پروبیوتیک Lactoibacillus acidophilusبا میانگین قطر هاله عدم رشد ۲۱/۳۳میلیمتر نشان داد.

 

5	5.5	6	6.5	7	7.5	8	8.5
A-1	–	+	+	+	+	+	+	+
A-2	–	+	+	+	+	+	+	+
B	–	+	+	+	+	+	+	+
G	–	+	+	+	+	+	+	+

 

12

 

جدول :۳نتایج میانگین قطر هاله عدم رشد حاصل از تاثیر ضدمیکروبی سویه های پروبیوتیک و محصول بایوآکوآ پوند ( با غلظت ۱۰۰۰و )mg/ml 500علیه ایزوله های جداسازی شده ویبریو

 

S. thermophilus

B. bifidum

L. casei

L. rhamnosus

S. salivarius

L. acidophilus

E. faecium

P. acidilactici

B. licheniformis

B. subtilis

BAP 500 mg/ml

BAP 1000 mg/ml

A-1

7.66±۱.۵۲

۶.۳۳±۰.۵۷

۶±۰

۲۰.۳۳±۰.۵۷

۲۱.۳۳±۰.۵۷

۱۲.۳۳±۰.۵۷

۱۶.۳۳±۱.۵۲

۱۰.۶۶±۰.۵۷

۱۱.۳۳±۱.۱۵

۱۰.۳۳±۰.۵۷

۱۲.۶۶±۱.۵۲

۹.۳۳±۰.۵۷

A-2

6.67±۰.۵۷

۶.۳۳±۰.۵۷

۶±۰

۱۶.۸۳±۰.۷۶

۱۹.۶۶±۰.۵۷

۱۱.۳۳±۰.۵۷

۱۳.۳۳±۱.۵۲

۱۰.۳۳±۰.۵۷

۱۲.۳۴±۰.۵۷

۱۱.۳۴±۰.۵۷

۱۱.۳۴±۱.۵۲

۸.۶۷±۰.۵۷

B

6.67±۰.۵۷

۶.۳۳±۰.۵۷

۳۰.۳۳±۱.۵۲

۲۱±۱

۱۸.۳۳±۰.۵۷

۱۴.۳۳±۰.۵۷

۲۹.۳۳±۱.۵۲

۱۸.۶۶±۰.۵۷

۶.۶۶±۰.۵۷

۱۳.۶۶±۰.۵۷

۲۲.۳۳±۱.۵۲

۶.۳۳±۰.۵۷

G

26.33±۱.۵۲

۲۲.۶۷±۱.۱۵

۱۲±۰

۲۰.۶۷±۰.۵۷

۶.۳۳±۰.۵۷

۱۵.۳۳±۰.۵۷

۲۱.۳۳±۰.۵۷

۲۰.۶۶±۰.۵۷

۲۰.۶۶±۱.۱۵

۶±۰

۲۱±۱.۷۳

۱۶.۶۷±۰.۵۷

 

13

 

تصویر :۷نتایج تاثیر ضدمیکروبی غلظت های مختلف محصول Bio-Aqua-Pondبر روی نمونه جداسازی شده G

 

14

 

تصویر :۸اثر ضدمیکروبی سویه پروبیوتیک Pediococcus acidilacticiعلیه جدایه های A-1و A-2

 

15

 

تصویر :۹اثر ضدمیکروبی سویه پروبیوتیک Bacillus subtilisعلیه جدایه های B

 

تصویر :۱۰اثر ضدمیکروبی سویه پروبیوتیک L. caseiعلیه جدایه های B

 

بر اساس نتایج حاصل از بررسی اثر ضدمیکروبی آنتی بیوتیک های رایج علیه نمونه های جداسازی شده (جدول ،)۴ بیشترین اثر ضدمیکروبی علیه هر چهار نمونه جداسازی شده مربوط به آنتی بیوتیک فلورفنیکل و کمترین اثر مربوط به آنتی بیوتیک پنی سیلین بود (شکل .)۱۱

 

16

 

تصویر :۱۱نتایج حاصل از اثر ضدمیکروبی آنتی بیوتیک های رایج علیه نمونه های جداسازی شده

 

17

 

جدول :۴نتایج میانگین قطر هاله عدم رشد حاصل از تاثیر ضدمیکروبی آنتی بیوتیک های رایج علیه ایزوله های جداسازی شده ویبریو از میگو

 

Sulfamethoxazole & Trimethoprim	Tylosin	Florfenicol	Enrofloxacin	Streptomycin	Gentamicin	Penicillin	Lincomycin
A-1	20.16±۰.۲۸	۲۰.۳۳±۰.۵۷	۶±۰	۱۵.۶۶±۰.۵۷	۲۳.۶۶±۱.۱۵	۱۴.۱۶±۰.۲۸	۳۴.۶۶±۰.۵۷	۲۵±۰
A-2	12.66±۱.۱۵	۲۰.۳۳±۰.۵۷	۶±۰	۱۶±۰	۲۵.۳۳±۰.۵۷	۱۴.۵±۰.۵	۲۷.۵±۰.۵	۲۱.۶۶±۱.۱۵
B	25.5±۰.۵	۳۰.۶۶±۰.۵۷	۸.۳۳±۰.۵۷	۱۷.۶۶±۰.۵۷	۲۵.۳۳±۰.۵۷	۱۴.۵±۰.۵	۳۱.۵±۰.۵	۲۴.۳۳±۰.۵۷
G	22.33±۰.۵۷	۲۸±۰	۶±۰	۱۸.۱۶±۰.۲۸	۲۴.۳۳±۰.۵۷	۱۱.۵±۰.۵	۲۸.۳۳±۰.۵۷	۲۳.۶۶±۰.۵۷

 

18

 

با مقایسه اثر ضدمیکروبی ۱۰سویه پروبیوتیک و همچنین آنتی بیوتیکهای رایج می توان دریافت که تاثیر ضدمیکروبی سویه پروبیوتیک Pediococcus acidilacticiعلیه جدایههای A-1و A-2از آنتی بیوتیکهای استرپتومایسین، جنتامایسین، پنی سیلین، لینکومایسین و تایلوزین بیشتر است، با این وجود از آنتی بیوتیک های انروفلوکساسین، فلورفنیکل و تری متوپریم سولفامتاکسازول کمتر می باشد. مطابق با نتایج حاصل تاثیر ضد میکروبی سویه Bacillus subtilisعلیه نمونه جداسازی شده Bتقریباا برابر یا بیشتر از همه آنتیبیوتیکهای مورد بررسی به جز فلورفنیکل می باشد. از سوی دیگر اثرات ضدمیکروبی سویه پروبیوتیک Lactobacillus acidophilusعلیه نمونه جداسازی شده Gفقط از آنتی بیوتیک های پنی سیلین، لینکومایسین و تایلوزین بیشتر ولی از سایر آنتی بیوتی های مورد بررسی کمتر بود. کاهش pHتا سطح ۵موثر و غیر کاربردی به نظر می رسد.

 

نتیجهگیری:

 

از آنجاییکه استفاده از آنتیبیوتیکها در درمان ویبریوز میگو امری پرچالش و هزینهبر است و همچنین صادرات میگو را با مشکل مواجه میکند، استفاده از روشهای مبتنی برپایهی زیست فناوری و امنیت زیستی کاربردی به نظر میرسد. مطابق بررسیها و تجربیات موجود، استفاده از مکملهای پروبیوتیک به عنوان یک محصول فناورانه یکی از این راه های مقابله با بیماری های باکتریایی می باشد. بر اساس نتایج به دست آمده از این طرح پژوهشی، سویه های منتخب پروبیوتیک اثرات ضدباکتریایی معنی داری علیه ویبریو پاراهمولیتیکوس به عنوان یکی از عوامل اصلی ویبریوز در آبزیان نشان دادند به طوری که حتی اثر ضدمیکروبی برخی سویه های پروبیوتیک از آنتی بیوتیک های رایج نیز بیشتر بود. از این رو استفاده از مکمل های پروبیوتیک در کنترل و مهار ویبریوز در استخرهای پرورش میگو توصیه می گردد.مکمل پروبیوتیک Bio-Aqua® Pondبا فرمولاسیون فعلی توانایی مقابله با عامل این همهگیری را دارد، با این وجود تقویت فرمولاسیون این محصول مطابق با داده های به دست آمده آزمایشگاهی به منظور مقابله موثر علیه ویبریوز انجام و محصول فناورانهی جدیدی بر پایه مطالعات تحقیقاتی طراحی گردید. مکمل پروبیوتیک بهبود دهنده کیفیت آب Bio-Aqua® Pond Vبا افزودن Enterococcus faeciumو افزایش غلظت سایر میکروارگانیسمهای موثره به فرمولاسیون، جهت تقویت عملکرد علیه ویبریو پاراهمولیتیکوس طراحی شده و در اختیار سازمان محترم شیلات ایران قرار میگیرد.